C18反相色譜柱是一種高效液相色譜柱，在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。利用反相色譜技術(shù)，其原理是表面修飾成疏水性的碳鏈（C18鏈）與待測(cè)物通過疏水作用相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的分離和純化。具體來說，C18反相色譜柱內(nèi)部填充有一定大小和形態(tài)的顆粒，表面涂層有一層碳鏈和疏水基團(tuán)。樣品在經(jīng)過樣品預(yù)處理后，通過進(jìn)樣器注入色譜柱中，在柱內(nèi)填充的顆粒表面發(fā)生反相作用，非極性物質(zhì)向柱內(nèi)靠攏，極性物質(zhì)則排斥柱內(nèi)顆粒而向外逸散。通過改變流動(dòng)相的極性和離子強(qiáng)度等條件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的選擇性分離和純化。
1、準(zhǔn)備工作：
檢查儀器設(shè)備是否正常運(yùn)行，確保柱子處于良好狀態(tài)。準(zhǔn)備好所需的溶劑和移動(dòng)相。
新柱在使用前需進(jìn)行處理。配制好65%的乙腈/水溶液，將色譜柱正確連接在色譜儀上，出口放空（注意出口端不可連上檢測(cè)器，以免污染），以低流速0.1ml/min~0.5ml/min進(jìn)行沖洗，等看見柱子出口有液體流出后，過20分鐘再接上檢測(cè)器，以循序漸進(jìn)的方法將流速調(diào)至1.0ml/min，繼續(xù)沖洗2~8小時(shí)。
2、樣品制備：
將待測(cè)樣品溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲?，并進(jìn)行必要的預(yù)處理，如過濾、離心等。
3、柱子裝填：
將C18反相柱裝入色譜柱架中，連接好進(jìn)樣系統(tǒng)和檢測(cè)器。
4、初始條件設(shè)置：
設(shè)置移動(dòng)相組成和流速，一般采用梯度洗脫方法，即開始時(shí)使用較弱的極性溶劑，逐漸改變?yōu)檩^強(qiáng)的極性溶劑。
5、進(jìn)樣：
將樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)注入柱中，注意保持穩(wěn)定的進(jìn)樣流速。
6、色譜分離：
開始進(jìn)行色譜分離，根據(jù)需求調(diào)整流速和梯度條件，使不同組分得到有效分離。
7、數(shù)據(jù)采集和解析：
利用檢測(cè)器對(duì)柱出口的化合物進(jìn)行檢測(cè)和記錄，獲取相應(yīng)的色譜圖。
8、結(jié)果分析：
根據(jù)色譜圖進(jìn)行結(jié)果分析，確定目標(biāo)化合物的峰位置、峰高、峰面積等參數(shù)。
9、色譜柱清洗：
如果樣品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流動(dòng)相，做完樣品后可直接用55%~65%乙腈/水或55%~65%甲醇/水沖洗色譜柱40~80分鐘，然后以純甲醇或乙腈沖洗30分鐘保存。
如果樣品分析中流動(dòng)相里含有緩沖液或酸或離子對(duì)試劑，做完樣品后需先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水沖洗一小時(shí)以上（如果色譜柱更長，則還需增加適當(dāng)時(shí)間），然后用55%甲醇/~水65%/水沖洗色譜柱30~60分鐘，最后用甲醇或乙腈以1ml/min流速?zèng)_洗30分鐘。
10、色譜柱再生：
當(dāng)色譜柱使用較長時(shí)間后出現(xiàn)柱壓力升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等情況時(shí)，可進(jìn)行再生。先用5%甲醇/水或5%乙腈/水反向沖洗60分鐘以上，然后用四氫呋喃以1ml/min流速?zèng)_洗30分鐘以上，再用65%甲醇/水或65%乙腈/水以1ml/min流速?zèng)_洗60分鐘，最后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘保存即可。
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